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Petrifilm?大腸桿菌/大腸菌群測(cè)試片含有VRB（Violet Red Bile）培養(yǎng)基，冷水可溶性凝膠及葡萄糖苷酶指示劑，可增強(qiáng)菌落計(jì)數(shù)效果。絕大多數(shù)E.coli（約97%）能產(chǎn)生?-葡萄糖苷酶與培養(yǎng)基中的指示劑反應(yīng),產(chǎn)生藍(lán)色沉淀環(huán)繞在大腸桿菌菌落周圍,表面覆蓋的膠膜可留住發(fā)酵乳糖的大腸菌群和大腸桿菌產(chǎn)生的氣體,約有95%的大腸桿菌產(chǎn)氣,形成藍(lán)色和藍(lán)紅色菌落并有氣泡相連接(氣泡距離菌落約有一個(gè)菌落直徑的范圍內(nèi))。
AOAC和FDA細(xì)菌分析學(xué)手冊(cè)(BAM)規(guī)定大腸菌群為格蘭氏陰性桿菌,發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣,大腸菌群菌落在Petrifilm?大腸桿群/大腸菌群測(cè)試片上產(chǎn)酸，PH指示劑使培養(yǎng)基變暗紅色，在紅色菌落周圍有氣泡者，為大腸菌群細(xì)菌。大腸桿菌鑒定在不同國(guó)家有所不同
一、測(cè)試大腸桿菌/大腸菌群 操作方法
1、未開(kāi)封時(shí)，冷藏于≤8℃（≤46℉），并在保存期內(nèi)用完，高溫度時(shí)，凝固水可以排除，包裝物最好于室溫啟開(kāi)。 2、已開(kāi)封的，將封口以膠帶封緊。
3、保存再封的袋于≤25℃（≤77℉）和溫度<50％，不要冷藏已開(kāi)啟的包裝袋，并于一個(gè)月內(nèi)使用完。
4、制備1：10和更大稀釋的食物樣品稀釋液，稱取或吸取食物樣品，置入適宜的無(wú)菌容器內(nèi)，如均質(zhì)袋、稀釋瓶、WhirlPak bag或者其他滅菌容器內(nèi).
5、加入適量的無(wú)菌稀釋液,包括Buffered peptone Buffer(IDF phopsphate buffer ,用0.0425g/L的KH2PO4調(diào)PH7.2) 、0.1%的蛋白膠水(ISO方法6887) 、緩沖蛋白膠水(ISO方法6579) 、鹽溶液(0.85-0.90%)、bisulfite-free letheen broth或蒸餾水.
但不可用含有枸櫞酸鹽、bisulfite or thiosulfate的緩沖液. 因?yàn)樗芤种咕L(zhǎng)。
6、攪拌或均質(zhì)樣品
酸性樣品的稀釋液用INNaoH調(diào)PH6.5－7.5，對(duì)堿性樣品的稀釋液用IN HCL調(diào)PH6.5－7.5。
7、將測(cè)試片置于平坦表面處，揭開(kāi)上層膜。 8、使用吸管將1ml樣液垂直滴加在測(cè)試片的中央處。
9、細(xì)心將上層膜緩慢蓋下，避免有氣光泡產(chǎn)生，切勿使上層膜直接落下。 10、使用壓板（平面底朝下）放置在上層膜中央處。
11、輕輕的壓下，使樣液均勻覆蓋于圓形的培養(yǎng)面積上，切勿扭轉(zhuǎn)壓板。 12、拿起壓板，靜置至少1分鐘以使培養(yǎng)基凝固。
13、測(cè)試片的透明面朝上，可堆疊至20片，對(duì)有一定濕度養(yǎng)箱能保持最少份損失是需要的。 14、可目視及用標(biāo)準(zhǔn)菌落計(jì)數(shù)器或其它的照明放大鏡計(jì)數(shù)，并可參考判讀卡計(jì)算菌落數(shù)。
15、可以分離菌落作進(jìn)一步鑒定，即掀起上層膜，由培養(yǎng)膠上挑取單個(gè)菌落。
二、測(cè)試大腸桿菌/大腸菌群 判讀方法
Petrifilm ColiformTM Coliform測(cè)試片含有VRB培養(yǎng)劑 (Violet Red Bile)，一種冷水可溶性的凝膠劑和四唑翁(tetrazollium)指示劑，可增強(qiáng)菌落計(jì)數(shù)效果。絕大多數(shù)E .coli（約占97%）能產(chǎn)生-葡萄糖甘酸酶與培養(yǎng)基中的指示劑反應(yīng)，產(chǎn)生藍(lán)色沉淀環(huán)繞在大腸桿菌菌落周圍，表面覆蓋的膠膜，可留住發(fā)酵乳糖的大腸菌群產(chǎn)生的氣體，約有95%的大腸桿菌產(chǎn)生，形成藍(lán)色或深藍(lán)上菌落并有氣泡相連接，氣泡大小約為1個(gè)菌落直徑。
AOAC和FDA細(xì)菌學(xué)分析手冊(cè)（RAM）規(guī)定大腸菌群為革蘭氏陰性桿菌，發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣。大腸菌群菌落在Petrifilm CC測(cè)試片上生長(zhǎng)產(chǎn)酸，PH指示劑使培養(yǎng)基顏色變深，在紅色菌落周圍有氣泡者，為大腸菌群細(xì)菌。大腸桿菌鑒定，在不同國(guó)家可以有變更（見(jiàn)培養(yǎng)時(shí)間和溫度部分指示）。
該測(cè)試片不能單獨(dú)測(cè)定E.coli O157,像大多數(shù)其他E.conliform培養(yǎng)基一樣,它沒(méi)有專門指示是否有任何0157菌株的存在.
AOAC確認(rèn)的方法:
E.coli=49(藍(lán)色菌落帶有氣泡)
Total coliform=87(紅色和藍(lán)色菌落帶有氣泡) No growth=0
注意圖2到8 培養(yǎng)基顏色的變化,隨著E.coliform菌數(shù)增多,培養(yǎng)基顏色變成暗紅色或藍(lán)紫色,背景的泡(沫)為培養(yǎng)基現(xiàn)象,不是大腸桿菌或大腸菌群生長(zhǎng)結(jié)果,見(jiàn)方框1.
E.coli connt=13
Total coliform count=28
Petrifilm Ec測(cè)試片菌落數(shù)適宜計(jì)數(shù)范圍是15-150,不要計(jì)算圓形培養(yǎng)基外的菌落,因?yàn)榕菝奚弦巡缓x擇性培養(yǎng)基.見(jiàn)圓圈! E.coli count=3
任何藍(lán)色菌落(藍(lán)色到紅藍(lán)色)表明有E.coli存在,正面照明增強(qiáng)形成藍(lán)色沉淀菌落的測(cè)定,圓圈1示為背面光照的紅藍(lán)菌落,圓圈2示為同一菌落的正面光照藍(lán)色沉淀更明顯些.
E.coli count=17
Estimated total coliform count =150
測(cè)試片面積約為20cm2,當(dāng)菌落數(shù)超過(guò)150 個(gè),為了估計(jì)菌落數(shù)可選擇其中一個(gè)或數(shù)個(gè)有代表性菌落的小方格(1cm2 )計(jì)算平均菌落數(shù),再乘以20方可得到整個(gè)測(cè)試片上的菌落數(shù)
Actual count～106
Petrifilm EC測(cè)試片菌落無(wú)法計(jì)數(shù)時(shí)至少有下列現(xiàn)象之一:
1.很多小菌落
2.有許多氣泡
3.培養(yǎng)基的顏色變深,由紅色到藍(lán)紫色
Actual count～108
高數(shù)量的大腸桿菌可以引起長(zhǎng)生區(qū)變成藍(lán)紫色.
Presumptive E.couli count～8
Estimated total coliform count～108
當(dāng)大腸菌群數(shù)>108 時(shí),一些大腸桿菌菌株可能產(chǎn)生少量氣體和不明確的藍(lán)色菌落.所有不帶氣泡的藍(lán)色菌落和(或)藍(lán)色環(huán)帶,推定為大腸桿菌需計(jì)數(shù),如有必要需挑取不帶氣泡的藍(lán)色菌落,進(jìn)行確認(rèn)試驗(yàn).
Actual count～108
當(dāng)有大量的非大腸菌群細(xì)菌如假單胞菌屬細(xì)菌存在時(shí),petrifilm EC 測(cè)試片培養(yǎng)基顏色呈黃色.
Total coliform count=3
食物顆粒為不規(guī)則形狀,且不帶氣泡.
Total coliform count=78
氣泡可有不同形狀,氣泡可使菌落撐散,使菌落輪廓似氣泡,見(jiàn)圓圈1和2.
人為氣泡可能是不當(dāng)?shù)牟僮魉?或是來(lái)自樣品內(nèi)的氣體,它們成不規(guī)則形狀,且不與菌落相連接.
例如1-10示為不同形狀氣泡與菌落連接情況，所有菌落應(yīng)記數(shù)。
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